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            ibidi血管生成、侵襲等實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象

            更新時(shí)間:2016-08-24   更新時(shí)間:2016-08-24   點(diǎn)擊次數(shù):5132次

            卡西波肉瘤是一種發(fā)生在包括口腔在內(nèi)的多種組織內(nèi)的,具有*的血管生成能力和侵襲能力的惡性腫瘤。卡西波肉瘤KS已經(jīng)被鑒定出多種細(xì)胞標(biāo)記物,但是其來源依然是一個(gè)迷。美國的科學(xué)家之前發(fā)現(xiàn)卡西波肉瘤相關(guān)的皰疹病毒(KSHV)能夠使大鼠的原代間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)感染,變形,并且重新編輯,使其分化為類卡西波肉瘤細(xì)胞。在這次的實(shí)驗(yàn)中,科研人員使用KSHV感染由多種組織來源的人原代間充質(zhì)干細(xì)胞,包括骨髓(MSCbm),脂肪組織(MSCa),牙髓,牙齦組織(GMSC),和乳牙。科研人員成功的建立起來KSHV感染的MSCa,MSCbm和GMSC(LTC-KMSCs)的穩(wěn)定株。其中,這些細(xì)胞表達(dá)了混合的KS標(biāo)記物,并且顯現(xiàn)出不同的血管生成、侵襲和變形的現(xiàn)象,而LTC-KMSCs表現(xiàn)出比未感染細(xì)胞更低的增殖率。進(jìn)而研究人員發(fā)現(xiàn)KSHV介導(dǎo)的血管生成是通過KSHV介導(dǎo)的microRNA激活了AKT通路。這些研究說明,在人體內(nèi)MSCs是KSHV的靶細(xì)胞,會建立起多種KSHV感染的模型。

             

            研究人員采用各種MSCs,鋪在基質(zhì)膠上,孵育8小時(shí),對比不同細(xì)胞的分枝數(shù)和節(jié)點(diǎn)數(shù)。

             

            Thyroid Transcription Factor 1 Reprograms Angiogenic Activities of Secretome

            L. Wood, N. Cox, C. Phelps, S. Lai, A. Poddar, C. Talbot and D. Mu

            Scientific Reports, 2016, 10.1038/srep19857

             

            (一)實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)方法

            1)細(xì)胞:  MSCs     ScienCell Research Laboratories (Carlsbad, CA) or Lifeline Cell Technology (Frederick, MD)

            2)培養(yǎng)基:      MSC medium         (MSCM; ScienCell Research Laboratories)

            3)基質(zhì)膠:    Matrigel Basement membrane       (BD)    10 µl per well

            4)耗材:    ibidi血管生成載玻片  (ibidi, 81506)

            5)其他:        細(xì)格紙                                  

             

            (二)實(shí)驗(yàn)步驟

            1)準(zhǔn)備基質(zhì)膠

            ① 將10μl的Basement membrane以5mg/ml的濃度鋪入ibidi血管生成載玻片的內(nèi)孔中,注意槍頭要垂直于內(nèi)孔的正上方加入Matrigel,防止有Matrigel流經(jīng)上孔而留下殘留膠。

            ② 蓋上ibidi血管生成載玻片的蓋子。

            ③ 準(zhǔn)備一個(gè)10cm的培養(yǎng)皿,放入浸過水的紙巾,制成一個(gè)濕盒。

            ④ 將ibidi血管生成載玻片放入培養(yǎng)皿中,蓋上培養(yǎng)皿蓋。

            ⑤ 37℃至少孵育30分鐘,使基質(zhì)膠固化。

            怎么知道加了合適體積的Matrigel:

            由于Matrigel流動性不強(qiáng),并且有可能移液槍不準(zhǔn)確,有可能10μl的膠不能填滿ibidi血管生成載玻片的下孔,這樣,必然會影響到實(shí)驗(yàn)的成像結(jié)果。這時(shí)用一張格子紙就能知道移液槍調(diào)整到多少能正好把下孔填滿。

             

            如上圖所示,垂直透過每個(gè)孔看下面的格子紙,如果格子被縮小了,那么就說明膠沒加滿,格子被放大了,那么膠就加多了,格子沒發(fā)生什么變形,這才是剛剛加滿下孔的狀態(tài)。

             

             

            3)鋪細(xì)胞

             

            ① 每孔種10000個(gè)細(xì)胞即可。準(zhǔn)備密度為2*105cells/ml的細(xì)胞懸液,充分混勻。

            ② 將膠已經(jīng)凝固的ibidi血管生成載玻片從濕盒中取出。

            ③ 每孔加入50μl的細(xì)胞懸液,注意保持槍頭垂直在上孔的上方,不要接觸下孔的凝膠。可以使用排槍。

            ④ 同樣用格子紙查看是不是加了足夠量的液體,如果沒有,加入無細(xì)胞的培養(yǎng)基,使上孔液體正好加滿。

            ⑤ 蓋上蓋,靜置,一段時(shí)間后,所有細(xì)胞都會沉下去落在Matrigel的表面。

             

            4)采集圖像并統(tǒng)計(jì)結(jié)果

            37度 5% CO2孵育8小時(shí)后,使用尼康Eclipse E400熒光顯微鏡采集圖像,并其分枝數(shù)和節(jié)點(diǎn)數(shù)進(jìn)行測量和統(tǒng)計(jì)。

             

            三)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

             

            對比LTC-KMSCs幾種細(xì)胞的成管效果。Mock是未被病毒感染的間充質(zhì)干細(xì)胞,KSHV會增強(qiáng)血管形成效果。圖像是鋪細(xì)胞后8小時(shí)采集,100倍放大倍數(shù)。

             

            1. 為了研究KSHV相關(guān)的miRNA的作用,對比了未被感染MSCs(Mock),感染的MSCs(KSHV)和用10個(gè)pre-miRNA簇缺失的突變病毒感染的MSCs(ΔmiR)和用這一突變的KSHV穩(wěn)轉(zhuǎn)的MSCs(ΔmiR Vector);以及用逆轉(zhuǎn)錄病毒重新表達(dá)這10個(gè)miRNA簇(ΔmiR Cluster)這幾組細(xì)胞的血管生成。發(fā)現(xiàn)這幾個(gè)miRNA對于細(xì)胞的血管形成有著非常重要的作用。(B) LY294002一種磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)的抑制劑,對于LTC-KMSCa血管形成有明顯的抑制作用。并且隨著LY294002濃度的上升,抑制作用會增強(qiáng)。兩組結(jié)果均是鋪細(xì)胞8小時(shí)后以100倍放大倍數(shù)采集圖像。

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